Tratado de Juan de Sanabria
O terceiro adiantado, Juan de Sanabria, assinou seu tratado em 22 de julho de 1547 na vila de Aranda de Duero. Dava-se-lhe por duas vidas os títulos de adiantado, governador, capitão geral, delegado maior e tenente das duas fortalezas que podia edificar. Devia fundar uma cidade sobre o Rio da Prata e outra na costa do Brasil. Seu território diferia do outorgado aos anteriores adiantados e seu limite sul apoiava-se no paralelo 31° sul, desde onde se contavam para o norte 200 léguas. Atribuía-se-lhe ademais os territórios que ficavam ao sul do paralelo 31° sul entre o Rio da Prata-Paraná e a costa do Atlantico, pelo que a despovoada Buenos Aires ficava fora da jurisdição. Considerando que a légua era 17,5 por grau, o limite norte se apoiava no paralelo 19° 34′ 17” sul, desde Pisagua a Uberaba, em onde atingia a linha do Tratado de Tordesillas e descia até Cananéia. Seguia para o sul pela costa atlántica, o Rio da Prata e o Paraná até para perto de Santa Elena (Entre Rios), desde onde ia ao oeste até atingir o oceano Pacífico na Cevada.
Antes de partir para América Juan de Sanabria morreu a fins de 1548, pelo que seu filho Diego de Sanabria assinou o tratado em 12 de março de 1549 para continuar com o tratado de seu pai. Enquanto demorava-se a expedição o rei Carlos I nomeou como governador a Francisco Alanís de Paz em 25 de outubro de 1549, mas não se embarcou a seu destino. A princípios de 1552 Diego de Sanabria adiantou a Juan de Salazar com parte da expedição, na que foi também foi sua mãe Mencia Calderón. Chegaram à ilha de Santa Catarina de onde a expedição se dividiu por desavenças entre os capitães Salazar e Hernando de Trejo, permanecendo o primeiro dois anos entre os portugueses da capitania de San Vicente antes de passar a Assunção e o segundo se estabeleceu em San Francisco de Mbiaza -fundada por Mencia Calderón a fins de 1552- que teve que abandonar por hostilidade dos portugueses até maio de 1554. Em 1555 partiram para Assunção ao ser atacada a população por corsários franceses.
Diego de Sanabria partiu com o resto da expedição, que foi dar ao mar Caraíbas, desde onde passou ao Peru e depois a Potosí. Em 4 de novembro de 1552 o rei pôs fim ao tratado de Sanabria por incumprimento.
Domingo Martínez de Irala e sucessores interinos
Em 1554 Irala enviou a Espanha a seu sobrinho Esteban de Vergara para que desse conta ao rei de seus serviços e, em recompensa, o rei o nomeou governador do Rio da Prata. A nomeação chegou a Assunção em 28 de agosto de 1555 levado pelo primeiro bispo do Rio da Prata, Pedro Fernández da Torre.
Durante o governo de Martínez de Irala o capitão Juan Romero em 1552 fundou a Villa de San Juan sobre o rio San Juan no departamento de Colónia (Uruguai), que foi imediatamente destruída pelos charrúas. O capitão García Rodríguez de Vergara fundou em 1554 a Villa de Ontiveros ao leste do rio Paraná e ao norte do salto do Guayrá.
Martínez de Irala morreu em 3 de outubro de 1556 e sucedeu-o como governador interino Gonzalo de Mendoza. Em 26 de fevereiro de 1557 o rei ordenou ao governador que fundasse um povoado onde estava San Francisco de Mbiaza e outro entre este e Assunção. Nesse ano Ruy Díaz de Melgarejo transladou a Villa de Ontiveros a uma nova população denominada Cidade Real do Guayrá, localizada para perto de 3 léguas ao norte da confluência do rio Paraná com o rio Piquirí.
Ñuflo de Chaves foi enviado desde Assunção a fundar uma cidade na região da lagoa dos Xarayes, para o qual partiu em 1558 com 23 navios pelo rio Paraguai. Como o lugar eleito lhe parecesse ruim e guiado pelos relatos dos locais sobre a presença de ouro, abandonou o projeto original e com uma parte de seus soldados atravessou o Chaco Boreal, fundando o 1º de agosto de 1559 a orlas do rio Guapay o povo de Nova Assunção da Barranca (mas destruída pelo aborígenes em 1564 e refundada pelo tenente de governador Lorenzo Suárez de Figueroa com o nome de San Lorenzo da Barranca em 1590, até que fosse transladada em 1595).
Em 20 de fevereiro de 1567 o presidente da Audiência de Lima, Lope García de Castro, depôs Ortiz de Vergara e nomeou a Juan Ortiz de Zárate como governador interino do Rio da Prata (Juan de Ortega voltou a seu posto de tenente de governador de Assunção até o 31 de julho de 1569) com a condição que conseguisse a confirmação real, pelo que viajou a Espanha deixando interinamente em 11 de dezembro de 1568 a Felipe de Cáceres como governador.
Em 8 de dezembro de 1568 Juan de Garay foi designado como delegado maior das províncias do Prata. Com este cargo, no final de 1569 deu a ordem ao capitão Ruy Díaz de Melgarejo para fundar uma cidade no Guayrá que chamar-se-ia Villa Rica do Espírito Santo, o que fez em 14 de maio de 1570 entre as nascentes dos rios Piquiri e Ivaí.
Em 14 de julho de 1572 Felipe de Cáceres foi deposto por acusação de heresia, encarcerado e enviado a Espanha. O tenente de governador de Assunção, Martín Suárez de Toledo, passou a ser governador interino do Rio da Prata, e exercendo o governo encarregou-lhe a Juan de Garay uma expedição pelo rio Paraná com o objetivo de fundar um povo que facilitasse à cidade de Assunção a saída marítima, fundando em 15 de novembro de 1573 a cidade de Santa Fé do Lado Cruz. Em 2 de março de 1574 Garay foi eleito pelo conselho santafesino como tenente de governador de Santa Fé.
