Tratado de Gregorio de Pesqueira Rosa
Estando ainda em vigor o tratado de Pedro de Mendoza, em 21 de agosto de 1536 a rainha Juana I de Castilla assinou um tratado com Gregorio de Pesqueira Rosa lhe outorgando uma concessão de 50 léguas de costa a contar desde a ilha de Cananéia até o rio de Santa Catalina, e 100 léguas para o interior. A capitulação tinha o objeto de cultivar especiarias (criar e granjear) durante 20 anos, para o qual em 9 de setembro de 1536 foi nomeado governador com direito a designar um herdeiro, retendo a coroa um terço dos benefícios que se produzissem.
Primeramente os doi licenzia y facultad para que por nos y en nuestro nombre y de la Corona Real de Castilla podais entrar en el dicho río de Solís que llaman de la Plata hasta la mar del Sur donde tengais doscientas leguas de luengo de costa de gobernación que comience desde donde se acaba la gobernazion que tenemos encomendada al Mariscal don Diego de Almagro hasta el Estrecho de Magallanes, y conquistar y poblar las tierras y provincias que oviese en las dichas tierras (…) entendiendo ser cumplidero al servicio de Dios y nuestro y por honra nuestra persona y por vos hazer merced prometemos de vos hacer nuestro gobernador y capitan general en las dichas tierras y provincias y pueblos del Rio de la Plata y en las dichas doszcientas leguas de costa del mar del Sur que comienzan desde donde acaban los límites que como dicho es tenemos dado en gobernación al dicho Mariscal don Diego de Almagro por todos los dias de nuestra vida con salario de dos mill ducados de oro en cada un año y dos mill de ayuda de costas.
A área concedida sobrepunha-se com as doações feitas pelo rei de Portugal em 1534, a capitanía de San Vicente (que chegava até a ilha de Mel) e a capitanía de Santana (até Laguna), e também com o tratado com Pedro de Mendoza, e pouco depois o rei mandou rasgar o tratado que ficou sem efeito.
Tratado de Gregorio de Pesqueira Rosa
Depois de que Mendoza morreu sem designar herdeiro, Carlos I assinou um tratado com Álvar Núñez Cabeça de Vaca em 18 de março de 1540 para o mesmo território. Como não se conhecia o destino de Ayolas -a quem Mendoza designou seu lugar tenente- o rei concedeu o governo provisório da província a Núñez Cabeça de Vaca, ficando subordinado a Ayolas se ele reaparecer, excepto pela ilha de Santa Catarina na que se lhe outorgava uma graça por 12 anos. Faltando Ayolas, Álvar Núñez Cabeça de Vaca seria vitalíciamente governador, capitão geral, alguacir maior, tenente das duas fortalezas que podia construir e em 24 de abril de 1540 lhe foi agregado o título em definitivo.
Os daremos título de nuestro gobernador y capitán general de las dichas tierras y provincias que así estaban dadas en gobernación al dicho D. Pedro de Mendoza y de las dichas dozientas leguas de costa en la dicha mar del Sur y de la Isla de Santa Catalina, por todos los días de vuestra vida con salario de dos mil ducados en cada un año, de los cuales aveis de gozar desde el día que os hizieredes a la vela (…)ostas.
Álvar Núñez Cabeça de Vaca partiu em 2 de novembro de 1540 com três barcos e 400 soldados, chegando ao porto de São Francisco e à ilha de Santa Catarina em 29 de março de 1541. Nesta ilha perdeu dois barcos, pelo que desde ali viajou por terra até Assunção, a onde chegou em 1 de março de 1542 depois de descobrir as cataratas do Iguazú e tomar posse das terras que denominou Campos de Vera. Não estando vivo Ayolas, assumiu o governo em 13 de março de 1542.
Irala foi nomeado mestre de campo pelo adiantado e partiu à frente de uma expedição em procura da serra da Prata. Em 6 de janeiro de 1543 Irala fundou a cidade de Porto dos Reis às orlas do rio Paraguai e da lagoa de Jarayes, sobre a costa da lagoa A Gaiba. Desde ali chegou em suas explorações até o Alto Peru, já conquistado por outros espanhóis. Em 26 de novembro de 1543 o adiantado subiu o rio até a nova população e procederia a fazer uma exploração pela região para regressar ao porto em 16 de dezembro do mesmo ano. Em 23 de março de 1544 o adiantado consultou a seus capitães sobre a hipótese de abandonar a nova população ou continuar habitando-a, pelo qual decidiriam pelo primeiro e partiram todos do Porto dos Reis, e chegariam doentes e cansados em 8 de abril à cidade de Assunção.
Em 25 de abril de 1544 Álvar Núñez Cabeça de Vaca foi destituído por uma revolta que restaurou a Domingo Martínez de Irala como lugar-tenente do governador e capitão geral por eleição dos insurgidos, e foi enviado preso a Espanha em 1545. A justificativa foi: o adiantado Cabeça de Vaca governava tiranicamente, excedendo em toda a ordem de S. M. Em 1545 Irala realizou uma expedição ao Chaco Boreal, deixando como seu lugar-tenente Francisco de Mendoza. Ao regressar a Assunção em 1549, encontrou que uma revolta tinha decapitado a Francisco de Mendoza, que ele tinha sido deposto de seu cargo no ano anterior, que foi eleito Diego de Abreu como tenente de governador-geral de Assunção, e que tinham obrigado ao capitão Gonzalo de Mendoza a que se proclamasse governador interino. Por nova eleição Irala foi reposto em 13 de março de 1549, fez justiça a Abreu e nomeou como tenente de governador de Assunção a Gonzalo de Mendoza.
Em setembro de 1548 Martínez de Irala enviou a Lima Ñuflo de Chaves a solicitar-lhe a nomeação do primeiro como governador do Rio da Prata ao presidente da Real Audiência de Lima. Em 20 de dezembro de 1548 o presidente Pedro da Gasca, dentro da jurisdição que fosse o governo de Nova Toledo, nomeou a Diego Centeno como governador, que se negou e morreu dantes de assumir. Atribuía-lhe uma jurisdição ao norte de Assunção, desde o trópico de Capricórnio até o Mato Grosso:
